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紅曲霉菌體殘渣酶解條件優化研究

[導讀]為提高紅曲霉菌(Monascus purpureus)體殘渣的利用率,采用機械破壁和酶解結合方法釋放胞內蛋白。

   紅曲以秈米為原料,采用現代生物工程技術分離出優質的紅曲霉菌(Monascus purpureus)經液體深層發酵精制而成,是一種純天然、安全性高、有益于人體健康的食品添加劑。采用紅曲霉制備紅曲的歷史悠久,在發酵培養過程中能產生大量紅曲色素,此外還能產生多種次級代謝產物,如莫納可林K、洛伐他汀、幾丁質酶、輔酶Q10等,因此紅曲具有降膽固醇、降血壓、降血糖以及預防冠心病和治療骨質疏松疾病等功能。我國很多企業利用紅曲霉進行工業化生產紅曲色素,浸提色素后,形成大量紅曲霉菌體殘渣(以下簡稱菌渣),富含蛋白質和活性物質,現主要應用于生產蛋白飼料,但其中很多大分子活性物質不利于人畜吸收,目前對菌渣酶解前后營養成分的變化規律研究很少,本試驗在前人研究基礎上,研究其酶解前后營養成分變化規律,采用機械破碎和纖維素酶結合方法釋放出多糖及菌體內蛋白,通過酶解將這些大分子物質降解成小分子,提升菌渣的營養品質,提高其利用率,為使菌渣得到高效利用提供理論依據。

材料與方法

材料與試劑

  菌渣:山東中惠生物科技股份有限公司;酸性纖維素酶(100 000 U/g):山東隆大生物工程有限公司;諾維信纖維素酶(100 U/g):諾維信中國投資有限公司;和氏璧纖維素酶(100 000 U/g)、復合酶(中性蛋白酶60 000 U/g、β-葡聚糖酶2 000 U/g、纖維素酶30 000 U/g):和氏璧生物技術有限公司;D-葡萄糖標準品(純度≥98%):大連美侖生物技術有限公司;苯酚(分析純)、三氯乙酸、三氟乙酸(色譜純):國藥集團化學試劑有限公司;濃硫酸(分析純):萊陽市鐵塔化工制品廠;甲醇(色譜純):美國Fisher公司。

儀器與設備

  YXQ-LS-60 SII立式壓力蒸汽滅菌器:上海博訊實業有限公司醫療設備廠;HZQ-Q全溫振蕩器:哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司;Agilent 1260 Infinity液相色譜儀:美國Agilent公司;SB-5200D超聲波清洗器:寧波新芝生物股份有限公司;細胞型1820D Molecular超純水儀:重慶摩爾水處理設備有限公司;TU-1810紫外可見光光度計:北京普析通用儀器有限責任公司;FA1004N 電子天平:上海精密科學儀器有限公司;HITACHI CR22GⅢ型離心機、L-8900氨基酸分析儀:日本Hitachi公司。



方法

菌渣破碎前處理

  菌渣粉碎后,過100目篩,獲得菌渣粉備用。

  菌渣粉中粗蛋白及氨基酸含量的測定凱氏定氮法檢測菌渣粉的粗蛋白含量;氨基酸測定儀檢測菌渣粉中氨基酸含量。

菌體細胞破碎與酶解水解菌渣蛋白

  稱量適量菌渣粉,加入蒸餾水在低溫條件下溶脹16 h,膠體磨研磨80 min,并在121 ℃滅菌30 min,待其涼后按照產品推薦量分別加入1%酸性纖維素酶、1%和氏璧纖維素酶、3%諾維信纖維素酶,混勻,置于37 ℃、160 r/min條件下酶解24 h,再分別在無菌條件下加入0.5%復合酶,37 ℃、160 r/min條件下繼續酶解24 h后,將水解液6 000×g離心10 min,收集菌渣,烘干至質量恒定后測定菌渣失重率,以失重率反映菌渣蛋白水解程度,其計算公式

菌渣水解液總糖檢測

  葡萄糖標準曲線的制作:精密稱取105 ℃干燥至恒質量的D-葡萄糖標準品200.000 mg,加適量水溶解并定容至100 mL容量瓶中,搖勻,配成質量濃度為2.00 mg/mL的葡萄糖標準液。分別吸取葡萄糖標準溶液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL至15 mL具塞試管中,加蒸餾水補足至1 mL,加入5%苯酚溶液0.6 mL,搖勻,再迅速加入3 mL濃硫酸,搖勻,沸水浴中加熱顯色反應15 min,迅速冷卻至室溫。另以蒸餾水1 mL同上操作加苯酚和硫酸進行顯色反應,作為空白對照。在最大吸收波長489 nm處測定吸光度值,以質量濃度為橫坐標(x),以吸光度值為縱坐標(y),進行線性回歸。

  苯酚-硫酸比色法測定菌渣水解液中總糖含量:精密量取菌渣水解液0.2 mL,取蒸餾水稀釋并定容至50 mL容量瓶中,精確量取供試液1 mL于具塞試管中,加入5%苯酚溶液0.6 mL,搖勻,再迅速加入3 mL濃硫酸,搖勻,沸水浴中加熱顯色反應15 min,取出后迅速冷卻至室溫,以蒸餾水作為空白對照,于波長489 nm處測定吸光度值。根據回歸方程,計算得到葡萄糖含量,以葡萄糖計水解液中總糖含量。

  菌渣水解液高效液相色譜檢測小分子化合物Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀檢測小分子化合物。色譜條件:色譜柱ZORBAX SB-C18 ( 4.6 mm×150 mm×5 μm),流動相A為體積分數為1%三氟乙酸水溶液,流動相B為甲醇;梯度洗脫程序:0~5 min,5%B;5~45 min,5%~100%B;45~55 min,100%B;55~56 min,100%~5%B。檢測器是二極管陣列(diode array detector,DAD)檢測器,檢測波長270 nm,柱溫30℃,流速1.0 mL/min,分析時間58 min;系統平衡色譜柱時間為15 min。

菌渣及菌渣水解液中小肽含量和總游離氨基酸含量檢測

  總游離氨基酸含量測定:取5mL樣品上清液于10mL試管中,準確加入5 mL 5%三氟乙酸溶液,混勻,于4 ℃7 000×g離心20 min,用0.45 μm的無機濾膜過濾。吸取濾液20 μL待測液注入L-8900全自動氨基酸分析儀,采用外標法定量測定。

  取適量菌渣水溶液及水解液,等體積加入10%三氯乙酸,在160 r/min搖床上振蕩30 min,4 000×g離心10 min,各取上清液10 mL于消化管中,按測定粗蛋白質方法消化、定容至100 mL。移取10 mL消化液蒸餾,測定菌渣水溶液及水解液中粗蛋白質含量。同時以蒸餾水作為空白。氨基酸態氮含量[14]:依據GB/T 5009.39—2003《醬油衛生標準的分析方法》中的甲醛值法進行測定。小肽含量= 粗蛋白含量-氨基酸態氮含量

結果與分析

菌渣粉中氨基酸含量和蛋白測定

凱氏定氮法檢測菌渣粉的蛋白含量為38.41%。菌渣粉中氨基酸含量檢測。可知,菌渣粉中的蛋白質含有17種氨基酸,氨基酸總含量占菌渣的21.90%,其中必需氨基酸占氨基酸總含量的37.20%,說明菌渣粉有較好的營養價值。

結論

  紅曲菌體殘渣是生產紅曲色素形成的下腳料,其中含有大量的纖維素等大分子化合物,蛋白含量高達38.41%,目前主要用于生產動物的蛋白飼料,但其中蛋白質分子較大,大部分為胞內蛋白,殘渣中游離氨基酸的含量極低,不易于被人畜充分吸收。通過細胞破碎結合纖維素酶水解,可將殘渣中的纖維素等大分子化合物降解為人畜易消化利用的養分,同時釋放胞內蛋白,并在復合酶作用下,菌渣的大分子蛋白被降解為小分子蛋白、小肽及游離氨基酸。結果表明,菌渣質量濃度、復合酶添加量、反應時間均對蛋白水解有顯著影響,最佳酶解條件為菌渣質量濃度為60 g/L、酸性纖維素酶添加量為1.0%、復合酶添加量為0.5%、水解時間為36 h。在此最佳條件下,菌渣蛋白的失重率可達27.86%,總糖含量達到7.38 g/L,通過高效液相色譜檢測,發現水解液中的小分子化合物組成明顯增多,水解液小肽含量達到83.95 mg/g,游離氨基酸含量達到22.31 mg/g。菌渣經過處理后,大分子物質含量降低,可溶性蛋白、小肽、游離氨基酸及可溶性總糖含量大大提高,有利于人畜的吸收,提高消化吸收率,改善適口性,使其品質得到一定程度的提升,提高了菌渣的綜合利用率,為將其開發成高營養價值的保健產品提供了理論參考。




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